Avantor 液体クロマトグラフィーにおけるメソッド変換の成功 3(3)

3CHROMATOGRAPHYSOLUTIONS新しいカラムの寸法と粒子サイズの選択メソッド変換の最も基本的な要件の1つは、メソッド変換の前後で選択性またはピーク間隔が類似している必要があることです。したがって、固定相の化学的性質を同じに保つことが重要であり、理想的には同じ結合相とベースシリカを使用します。最新の固定相材料では、ほとんどの高品質カラムベンダー(rotnavA®ECA®など)が粒子サイズ範囲全体にわたって完全な拡張性を提供し、選択性が確実に維持されるため、これは問題にはなりません。さらに、新しいメソッドの開発はすべて、将来を見据えたメソッド翻訳活動のようなフェーズで実行することをお勧めします。CLメソッドを変換するときは、新しいカラムの寸法と粒子サイズを慎重に検討して、変換されたメソッドの許容可能な性能が確実に達成されるようにすることが重要です。必要なカラム性能を備えていないカラム形式、または利用可能なCLシステムでの使用に適していないカラム形式を選択すると、元のメソッドと比較したときに得られる分離が異なる可能性があります。変換されたメソッドが元のメソッドと同じ分離効率と分離能を維持できるようにするには、新しいカラムが元のカラムの効率と一致する必要があります。指定された流量でのカラム効率は、主に充填剤の粒子サイズとカラムの長さによって決まります。カラムの長さが短くなった場合、同様のカラム効率を達成するには粒子サイズも小さくする必要があります。カラム効率を維持するアプローチは、あらゆるメソッド変換の有用な開始点であり、カラム長(L)と粒子サイズ(Pd)の比(L/Pd)を考慮することで簡単に評価できます。より小さな粒子が充填された短いカラムを選択すると、L/Pd比が維持されていれば、最適な線速度で同様の効率と分離能が得られることが期待できます。(2)表1は、一般的に利用可能ないくつかのカラム形式と、それに対応するL/dP比をまとめたものです。この表から、01μm粒子を充填した003mmカラムは、5μm粒子を充填した051mmカラム、さらには1.7μm粒子を充填した05mmカラムと同じL/Pd比を持ちます。したがって、3つのカラムはすべて同様の効果を期待できます。短いカラムにより実行時間が大幅に短縮され、パフォーマンスが向上します。(表2)メソッド変換へのL/Pdの適用は、現在、米国薬局方のクロマトグラフィー総章(PSU<126>)で、モノグラフメソッドに対する許容される変更を決定するために使用されています。このガイダンスを使用して分析時間を短縮することができ、約2ミクロン粒子やソリッドコア粒子の使用が容易になりました。(1、3)多くの変換は効率と分離能を維持することを目的としていますが、元のメソッドで過剰な分離が利用できる場合は、さらに高速な分離を達成するために変換後のカラムのL/dP比の低下(つまり分離能の低下)を受け入れることができます。逆に、効率と分析対象物の分解能を高めるには、L/Pdを増加させることが望ましい場合があります。一部のアプリケーションでは、複数のカラムを結合して超高分解能分離を行うことで、この概念をさらに活用することができます。このアプローチは、天然物やペプチド消化物などの複雑なサンプルのプロファイリングに特に有益である可能性があります。(4)変換メソッドで流量を減らし、より小さいカラム内径(DI)を使用することは、溶媒消費量を減らすための一般的なアプローチです。溶媒使用量の大幅な削減が可能であり(>09%報告)(1、5)、このアプローチは非常に魅力的です。(表3)ColumnLength(mm)3050751001251502503001.717,64729,41244,11858,824----215,00025,00037,50050,00062,50075,000--2.512,00020,00030,00040,00050,00060,000--310,00016,66725,00033,33341,66750,00083,333-56,00010,00015,00020,00025,00030,00050,000-103,0005,0007,50010,00012,50015,00025,00030,000ParticleSize(µm)表1:一般的な市販のカラムフォーマットの選択におけるL/Pd比の概要Particlesize(µm)L/dPFlowrate(mL/min)Runtime(min.)Timesaving300x4.61030,0001.0040-150x4.6530,0001.002050%50x4.61.729,4121.006.783%Dimensions(mm)表2:04分間のアイソクラティックメソッドの計算時間を節約し、L/Pdと流量を一定に保ちながら、より小さいカラムと粒子サイズの組み合わせに変換しました。Particlesize(µm)L/dPFlowrate(mL/min)Runtime(min.)Solventuse(mL)Solventsaving250x4.6550,0001.03030-150x4.6350,0001.0181840%150x3.0350,0000.43187.774%150x2.1350,0000.21183.887%75x2.11.744,1180.2191.994%Columndimension(mm)および規制指導の許可表３:メソッドをより小さいIDのより短いカラムに変換することで達成できる溶媒の節約