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8CHROMATOGRAPHYSOLUTIONS緩衝液と移動相をろ過して、塵や粒子を除去することもできます。バッファーまたは添加剤を含む移動相を使用するグラジエントメソッドの場合バッファーまたは添加剤を両方の移動相に同じ濃度で含めることを強くお勧めします。多くの場合、バッファーまたは添加剤はAラインにのみ含まれ、有機溶媒はBラインに含まれます。このアプローチでは、グラジエントプログラム全体で緩衝液濃度やHp勾配が作成されるため、メソッドの再現性や堅牢性に問題が生じる可能性があります。さらに、VU検出を使用するメソッドの場合、添加剤が検出波長で大幅に吸収する場合、図8に示すように、ベースラインが傾斜する可能性があります。この状況は、添加剤をBラインに組み込むことで容易に解決されます。微生物の増殖は、緩衝液の水溶液にとって潜在的な問題です。バッファー調製には適切な有効期限を設定することが常に重要です。一般に、中性Hpの低濃度バッファーの有効期限は、酸性バッファーの濃縮ストック溶液よりも短くなります。最後に、バッファーの沈殿や微生物の増殖のリスクを軽減するために、使用後にCLシステムからバッファーを除去することを常に推奨します。これは、05:05の水:有機移動相を使用して実現できます。同様に、カラムの寿命を延ばすために、保管前にCLカラムから添加剤と緩衝液を除去することが重要です。逆相カラムの場合、固定相の脱湿または崩壊を引き起こす可能性があるため、これを001%水で実行しないでください。結論新しいCLおよびCL-SM分離を開発する場合、分析物の保持、選択性、およびピーク形状を制御および最適化するために、移動相の組成を慎重に検討することが重要です。イオン化可能な分析物の場合、移動相のHpは保持力に劇的な影響を与える可能性がある重要なパラメーターです。移動相バッファーは、移動相のHpを制御するために一般的に使用され、堅牢で再現性のある分離の実現に役立ちます。利用可能な緩衝液や添加剤の範囲が広いため、適切な移動相を選択するのは複雑で困難な作業となる場合があります。ただし、いくつかの重要な概念を注意深く検討することは、適切なバッファーを確実に選択するのに役立ち、メソッド開発の成功に劇的な影響を与える可能性があります。このホワイトペーパーでは、分析対象物の特性を考慮することで、分析者が保持力がHpによってどのような影響を受けるか、および最適な緩衝液を選択する方法をよりよく理解できるように概説しました。図8:rotnavA®ECA®lecxEC81-PFPカラムでの非ステロイド性抗炎症薬のグラジエント分離、Column:Avantor®ACE®Excel2C18-PFP,50x3,0mm;Gradient:5to100%Bin5minutes;Flowrate:1,20ml/min;Injectionvolume:1µl;Temperature:40°C;Detection:UV,214nm.Sample(inorderofelution):1.2-Acetoxybenzoicacid,2.Phenacetin,3.Sulindac,4.Tolmetin,5.Naproxen,6.Flurbiprofen,7.Diclofenac,8.Phenylbutazone,9.Meclofenamicacid.A:0,1%formicacid(aq)B:MeCN:H2O9:1(v/v)min0123456mAU-250-200-150-100-50050100A:0,1%formicacid(aq)B:0,1%formicacidinMeCN:H2O9:1(v/v)min0123456mAU-50050100150200250300min6A:0,1%formicacid(aq)B:0,1%formicacidinMeCN:H2O9:1(v/v)min0123456mAU-50050100150200250300Aラインのみ(上)とAラインとBラインの両方(下)に移動相添加剤を含めた場合の効果を示しています。
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Prices,product,and/orservicesdetailsarecurrentwhenpublishedandsubjecttochangewithoutnotice.|Certainproductsorservicesmaybelimitedbycountry,federal,state,provincial,orlocalregulations.|VWR,partofAvantor,makesnoclaimsorwarrantiesconcerningsustainable/greenproducts.Anyclaimsconcerningsustainable/greenproductsarethesoleclaimsofthemanufacturerandnotthoseofVWRInternational,LLCand/orAvantor,Inc.oraffiliates.Offersvalidincountrieslistedabove,voidwhereprohibitedbylaworcompanypolicy,whilesupplieslast.|TrademarksareownedbyAvantor,Inc.oritsaffiliates,unlessotherwisenoted.|Visitvwr.comtoviewourprivacypolicy,trademarkowners,andadditionaldisclaimers.©2020Avantor,Inc.Allrightsreserved.04/2020-EL-KS0420Lit.No.931079W-ZPROVWRI25766-EN1J.Dolan,“GuidetoHPLCandLC-MSBufferSelection“https://uk.cmd.vwr.com/bin/public/idoccdownload/10106347/ACE%20-%20A%20guide%20to%20HPLC%20and%20LC-MS%20buffer%20selection?s=1059060:1&sort=2&iframe=1&hide_header=1&type=10001&val=&category=10005&manufacturer=10533&act=search&show=11122L.R.Snyder,J.J.Kirkland,J.L.Glajch,PracticalHPLCMethodDevelopment(1997)2ndEd.,WileyInterscience,NewYork3S.Ahuja,S.Scypinski,HandbookofModernPharmaceuticalAnalysis(2011)2ndEd.,Elsevier,USA(2011)4L.R.Snyder,J.J.Kirkland,J.W.Dolan,IntroductiontoModernLiquidChromatography(2010)3rdEd.,JohnWiley&Son,NewJersey5D.R.Stoll,D.M.Makey,LCGCNorthAmerica37(2019)444-4496Avantor®ACE®HILICMethodDevelopmentGuidehttps://uk.cmd.vwr.com/bin/public/idoccdownload/10149211/ACE%20HILIC%20Method%20Development%20Guide?s=1079623:1&sort=2&iframe=1&hide_header=1&type=10001&val=&category=10005&manufacturer=10533&act=search&show=11127S.Lupo,T.Kahler,LCGCEurope35(2017)424-4338ChromatographyToday13(2020)24-26緩衝液の溶解度、濃度、使用可能なHp範囲、さまざまな検出モードとの互換性など、重要な実際的な考慮事項についてもさらに説明されています。重要なのは、移動相の調製にはいくつかの異なるアプローチが頻繁に行われることです。これは、他の研究室やユーザーがメソッドを確実に再現して運用できるように、手順を検討し、正確に文書化することが重要であることを意味します。最後に、rotnavA®ECA®などの最新の超高純度CL固定相を使用すると、メソッドの再現性と堅牢性が向上し、メソッドのライフサイクル全体を通じてメソッドの失敗リスクを最小限に抑えることができます。7CHROMATOGRAPHYSOLUTIONSこの例では、緩衝液濃度が低いと、レボドパとエピネフリンの間で不十分な分離が得られます。緩衝液濃度が増加すると、分離が向上します。この例は、通常は主要なメソッド開発パラメーターとしては使用されませんが、緩衝液濃度の評価が有用である可能性があることを示しています。カラムについての考慮事項前述したように、ピーク形状と再現性を改善するための新しい方法の開発には最新の高純度シリカから製造されたカラムを使用することを強くお勧めします。さらに、メソッド開発を開始するときは、カラムで実行した以前のメソッドが固定相の特性を変えていないことを確認するために、新しいカラムを使用する必要があります。これは、AFTなどのイオンペア添加剤を使用した場合に特に重要です。これらの添加剤はカラムの選択性を変える可能性があり、完全に除去できない場合があるためです。このアプローチに従わない場合、古いカラムではメソッドの開発に成功しても、新しいカラムで実行すると失敗する可能性があります。新しいメソッドの移動相のHpと緩衝液を選択する場合、カラムの安定性を考慮することが重要です。一般に、カラムの寿命を最適化するには、ほとんどのシリカカラムをHp2～8で使用する必要があります。低いHpでは加水分解により固定相の損失が生じる可能性がありますが、Hp8を超えるとシリカの溶解が発生する可能性があります。どちらのプロセスも高温で加速されます。したがって、多くの逆相カラムは高Hp移動相では使用できません。高Hpに耐えられる多数のカラムが市販されており、通常はハイブリッド有機シリカ材料、ポリマーベース、または改良された結合技術を利用して製造されています。rotnavA®ECA®lecxECrepuS81、rotnavA®ECA®eroCartlUCrepuS81、およびrotnavA®ECA®eroCartlUrepuS-lyxeHlynehPは、より広いHp範囲で使用するために開発された新しい固定相です。製造プロセス中に独自のカプセル化結合技術(EBT™)を使用することは、これらの固定相がpH1.5～11.0の拡張pH範囲にわたって移動相とともに使用できることを意味します。(Avantor®ACE®ExcelSuperC18の場合はpH1.5～11.5) より広範囲の移動相Hpを扱うことができるため、クロマトグラファーはイオン化分析物を扱う際のメソッド開発ツールとしてHpを完全に調査するための柔軟性が高まります。[8]図7は、メソッド開発中に高Hp移動相を調査できる機能が、イオン性化合物を扱う場合にいかに強力なアプローチとなり得るかを示しています。この場合、高Hp移動相により、選択性と分析対象物の分解能が大幅に向上するだけでなく、塩基性分析対象物の保持力とピーク形状も改善されます。追加のヒントと優れた実践方法CL移動相を作成するときは、常に高純度の緩衝塩、添加剤、溶媒(CLPHグレード以上)を使用することが重要です。バッファーの純度は、アイソクラティック分離よりもグラジエント分離の方が重要になる傾向があります。これは、バッファーの不純物がカラム上に蓄積し、グラジエントが進行するにつれて不純物ピークとして溶出される可能性があるためです。図7:rotnavA®ECA®eroCartlU2.5CrepuS81カラムで低Hpおよび高Hp移動相を使用した中性およびイオン化可能な分析物を含むサンプルの分離®®Column:Avantor®ACE®UltraCore2.5SuperC18,50x2,1mm;Mobilephase(lowpH):A:20mMammoniumformatepH3,0(aq),B:20mMammoniumformatepH3,0inMeCN/H2O9:1v/v;Mobilephase(highpH):A:0,1%NH3(aq)B:0,1%NH3inMeCN/H2O9:1v/v;Gradient:3to100%Bin5minutes;Flowrate:0,60ml/min;Injectionvolume:1,5µl;Temperature:40°C;Detection:UV,254nm.012345Time/min.217394861251011217348,961251011pH3,0(20mMAmmoniumformate)pH10,7(0.1%NH3)Figure7
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