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vwr.com|Chromatography2CLPHおよびCLPHUで正確で再現性のある結果を得るための2つの基本要件は、優れたピーク形状と分析対象間の適切な分離です。逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)における良好な対称ピーク形状はカラム、移動相、およびサンプル溶媒、注入量、緩衝液の種類、強度などのその他のさまざまなパラメーターを適切に選択することによって得られます。分解能方程式と選択性、最も強力なパラメータよく知られた形式の分離方程式(式1)は、カラム効率(N)、保持(k)、および選択性(α、または相対保持)の間の関係と、それらがピークペア間の分離に及ぼす影響を説明します。この方程式をグラフで表すと、選択性の変化が分析対象物の分離に最も劇的な影響を与えることが簡単に証明できます。(図1)方程式1.効率、保持力、選択性を含む分離方程式図1.分離度の方程式と分離度に対するa、N、kの相対的な寄与(sR)図2.k=3.0および3.3で溶出する分析物を1lm/分で実行した05mm、5μmカラムからのシミュレートされたクロマトグラム図3.保持率の07.8%増加によるシミュレートされたクロマトグラム(k)1.001.051.101.151.201.250.00.51.01.52.02.53.005000100001500020000250000510152025NkααNkResolution(Rs)Zhao,J.H.andP.W.Carr.AnalyticalChemistry,(1999)71,2623-2632EfficiencySelectivityRetentionRs=k1+kα-1α√N4..図4.効率(N)が07.8%向上した結果のシミュレートされたクロマトグラムここで、N1とN2はピーク1と2の理論段数、k1とk2はピーク1と2の保持係数、α=k2/k1です。図1では、1,00<α<1,52の領域では分解能と選択性がほぼ線形であり、α値が1,50より大きい場合は線形であることが明確に示されています。超高純度の低金属含有シリカで作られた高品質カラムは、テーリングピークやフロンティングピークの原因となる、酸性および塩基性分析対象物の固定相との二次相互作用を最小限に抑える上で重要な役割を果たします。一連の安定した独自の結合化学を超高純度のシリカ粒子と組み合わせることで、メソッド開発プロセスをより迅速に、より包括的に、より効果的に行うことができます。さらに、1.7などのより小さい粒子サイズのより短いカラム形状を選択することによって、2および3μmの粒子を使用すると、分析対象物の「クロマトグラフィー選択性空間」の包括的なメソッド開発と評価をより迅速に行うことができます。μm
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Chromatography|vwr.com3分離に対する選択性の影響は、Nと保持kの影響よりも支配的であり、0005プレートを超えるN値と5を超えるk値で影響が減少することが示されています。分離方程式におけるこれら3つの変数のそれぞれの影響は、シミュレートされたクロマトグラムを使用して実証することもできます。理論段数3424を供給できる05mm、5μmカラムを考えてみましょう。図2は、それぞれk値3,0および3,3で溶出する2つの分析物の初期分離を示しています。これらのk値は、α値1,1および解像度1,2に対応します。後続の図は、k、N(同じカラム形状の5μmから3μm粒子への変更と一致)、およびαをそれぞれ07.8%変更した結果と、それらの変更が計算された分解能値にどのような影響を与えるかを示しています。図3は、両方の分析物のkを07.8%増加させた結果のシミュレートされたクロマトグラムを示しています。これにより、分解能は8.3%しか増加しません。図2の元の分離を取得し、Nを07.8%増加すると、解像度が13%増加して1.5になることがわかります(図4)。最後に、図2の元の分離を取得し、αを07.8%増加させると、解像度が575%という劇的な向上をもたらします(図5)。これは、これまでに示した他の値と比較して大幅な解像度の向上です。結論として、これらのシミュレーション結果とメソッド開発および分析全般から考えると、クロマトグラフィーの選択性は分離方程式の中で最も強力な項目であり、分析物の分離能を最大化するには保持率や効率よりもはるかに効果的です。選択性に影響を与えるCLパラメータCLPRの選択性に影響を与えるパラメーターがいくつかあり、それらを表1に示します。アイソクラティック分離の場合、固定相、有機溶媒の選択、移動相のHp(イオン性分析物の場合)、および有機溶媒の%が選択性に最も大きな影響を及ぼします。選択性にあまり影響を与えないパラメーターには、カラム温度、バッファーの選択、バッファー濃度、および移動相添加剤の選択と濃度が含まれます。グラジエント分離の場合、グラジエント勾配(Δ%有機溶媒/分)および機器グラジエント遅延ボリューム(別名ドウェルボリューム)に加えて、これらすべてのパラメーターが選択性に影響します。redynSと共同研究者[1]は、選択性を変更する能力の観点から、これらのパラメータの数について相対的なランク付けを提案しました。その研究やその後の他の出版物や実験から、分析物の相互作用のさまざまな保持モード/メカニズムを備えたカラムを適用することが、CLPRで分離能を最適化するための最も強力なアプローチの1つであることは明らかです。1表.PCLPRの選択性に影響を与える可能性のあるパラメーターParameterOptionsStationaryphaseC18/C8,phenyl,polar-embedded,cyano,PFPpHpH2to8formostcolumns;1,5to11,5forbase-stablephasessuchasACESuperC18Organicmodifieracetonitrile,methanol,acetonitrile/methanolblend(1∶1),2-propanol,ethanol%OrganicmodifierMostphasesfrom5to10%upto95%;wettablephases0to95%Columntemperature10to60°CformostcolumnsatlowpH,typically40°Cmax.formidorhighpHBufferchoicePhosphate,formate,acetate,trifluoroaceticacid(TFA),formicacid,aceticacidBufferconcentrationTypically,from5to50mMAdditiveconcentrationForion-pairingreagents,concentrationcanvaryfrom2to100mMGradientsteepnessTherateof%organic/mincanbevariedtoadjustselectivityandresolutionInstrumentdelayvolumeGradientdelayvolumecansometimesaffectbothretentionandselectivity,especiallyforearlyelutingcomponents図5.選択性(α)が70.8%増加した結果得られるシミュレートされたクロマトグラム
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