Technical note J.T.Baker Cell Lysis Solutionによる 低発泡性について 2(2)

Avantor®isaleadingglobalproviderofmissioncriticalproductsandservicestocustomersinthebiopharma,healthcare,education&government,andadvancedtechnologies&appliedmaterialsindustries.Weoperateinmorethan30countriesanddeliveranextensiveportfolioofproductsandservices.Wesetscienceinmotiontocreateabetterworld.TrademarksareownedbyAvantor,Inc.unlessotherwisenoted.©2022Avantor,Inc./2022-AB-JSThereareseveralmechanicalandchemicalmethodsforcelllysis1.Therudimentarymechanicaltechniquetoliberaterecombinantadeno-associatedvirus(AAV)vectorsfromcellsisfreeze/thawcyclingfollowedbyalow-speedcentrifugationclarificationstep.However,thistechniqueisnotappropriateforlargescalepurificationofAAVsbecauseitisdifficulttoscale-up.Mechanicalhomogenizationcanbeusedtodisruptthemembranethroughhighshearforces.Althoughthismethodisscalable,ithasadisadvantageofproductlossduetoshearstress-inducedaggregationandprecipitationofviralvectors.ChemicalmethodssuchasOctoxynol-9(alsosoldasTriton™X-100,)sodiumdeoxycholate,andsodiumdodecylsulfate(SDS)havebeenusedasprimarydetergentsforcelllysis2asthecelldisruptionislessharshthanmechanicalmethodsontheproteinorviralvectorparticlesbeingpurified.Theuseofdetergentsforcelllysiscreatesaseparatechallengeinthegenerationoffoamwhileprocessing,whichcanleadtoproductlossandmanufacturingflooradverseevents.Amongchemicalmethods,TritonX-100hasbeenthepreferreddetergentforviralvectorpurificationprocessesduetoitssuperiorperformance2.However,researchhasshownthatTritonX-100causesacuteoraltoxicity,eyedamage,skinirritation,andchronicaquatictoxicity3.Asaresult,thedetergenthasbeendesignateda“substanceofveryhighconcern”bytheEuropeanChemicalsAgency’sRegistration,Evaluation,AuthorizationandRestrictionofChemicals(REACH)regulations,inDecember20124.REACHisaEuropeanUnionregulationenactedinDecember2006toaddresschemicalsafetyonbothhumanhealthandtheenvironment.ThedetergenthasbeenbannedforuseinEuropesinceJanuary2021andotherregionsoftheglobemayfollow5.Inthisstudy,thefoamheightgenerationoftheJ.T.Baker®CellLysisSolutionwascomparedtoTritonX-100todeterminewhetherJ.T.Baker®CellLysisSolutionmaypotentiallycreateadversefoamingconditionsduringviralvectorbioprocessing.MATERIALSANDMETHODSInordertoassessthefoamingcharacteristicsoftheJ.T.Baker®CellLysisSolutioncomparedtoTritonX-100,foamheightdeterminationswerecarriedoutaccordingtoASTMD1173,StandardTestMethodforFoamingPropertiesofSurface-ActiveAgents6.Allfoamheightmeasurementswerecarriedoutat25°C(ambienttemperature)usingaRoss-MilesFoamApparatus(VWRCat#14007-876)byWilmad-Labglass.ThefoamheightofJ.T.Baker®CellLysisSolutionandTritonX-100wasmeasuredat0.1%detergentconcentrationattimezeroandafter5minutesofhold.J.T.BAKER®CELLLYSISSOLUTIONFOAMHEIGHTGENERATIONThefoamheightresultsattimezeroandafter5minutesofholdtimeareshowninFigure1.ThefoamheightgeneratedbyJ.T.Baker®CellLysisSolutionwasabout28%and33%lowerattimezeroandafter5minutesofholdcomparedtoTritonX-100,respectively.Thefoamdissipationratewasalsoquickerfornovelcelllysissolution(2.9%perminute)thanTritonX-100(1.6%perminute).Thefoamdissipationratewascalculatedas:Figure1:FoamdevelopmentassessedbyRossMilesfoamheightanalysisattwotimepoints.020406080100120140TritonX-100FoamHeight(mm)T=0(baseline)CellLysisSolutionT=5minCONCLUSIONSFoamingofdetergent-basedcelllysissolutionsisamanufacturingchallengethatmustbemanagedcarefully.Excessivefoamformationnotonlycreatesamessonthemanufacturingfloor,butitisalsodifficulttoclean.Generationoffoamcanalsoresultinlossofyieldoftheproteinorviralvectorthatisbeingisolated.Ideally,solutionsusedforcelllysisshouldbeabletolysecellswithoutcreatingtoomuchfoam.J.T.Baker®CellLysisSolutionfoamsabout30%lessanddissipatesquickerthanTritonX-100.ThislowfoamingmakesJ.T.Baker®CellLysisSolutioneasytouse.J.T.Baker®CellLysisSolutionisalsoreadytouseandmeetstheOECDguidelineforreadilybiodegradablematerialaccordingtoOECD301.REFERENCES01.Islam,M.S.,Aryasomayajula,A.&Selvaganapathy,P.R.Areviewonmacroscaleandmicroscalecelllysismethods.Micromachines8,(2017).02.DiasFlorencio,G.etal.Simpledownstreamprocessbasedondetergenttreatmentimprovesyieldandinvivotransductionefficacyofadeno-associatedvirusvectors.Mol.Ther.-MethodsClin.Dev.2,1–7(2015).03.Moleirinho,M.G.etal.Clinical-gradeoncolyticadenoviruspurificationusingpolysorbate20asanalternativeforcelllysis.Curr.GeneTher.18,366–374(2018).04.“Candidatelistofsubstancesofveryhighconcernforauthorisation”.EuropeanChemicalsAgency.RetrivedMarch22,2022.05.Farcet,J.,Kindermann,J.,Karbiener,M.&Kreil,T.R.DevelopmentofaTritonX‐100replacementforeffectivevirusinactivationinbiotechnologyprocesses.Eng.Reports1,1–10(2019).06.ASTMInternational.StandardTestMethodforFoamingPropertiesofSurface-ActiveAgents.(2007)07.structureandcellinteractions.GeneTherapyvol.807(2011).08.Rayaprolu,V.etal.Comparativeanalysisofadeno-associatedviruscapsidstabilityanddynamics.J.Virol.87,13150–13160(2013).Foamdissipationrate=Foamheightatt=0-Foamheightatt=5mintime(5min.)-JSThereareseveralmechanicalandchemicalmethodsforllysis1.Therudimentarymechanicaltechniquetoliberaterecombinantadeno-associatedvirus(AAV)vectorsfomcellsisfreeze/thawcyclingfollowedbyalow-speedcentrifugationclarificationstep.However,thistechniqueisnotappropriateforlargescalpurificationofAAVsbecauseitisdifficulttoscale-up.Mechanicalhomogenizationcanbeusedtodisrupttemembranethroughhighshearforces.Althoughthismethodisscalable,ithasadisadvantageofproductlossduetoshearstress-inducedaggregationandprecipitationofviralvectors.ChemicalmethodsuchasOctoxynol-9(alsosoldasTriton™X-100,)sodiumdeoxycholate,andsodiumdodecylsulfate(SDS)havebeenusedasprimarydetergentsforcelllysis2asthecelldisruptionislessharshthanmechanicalmethodsontheproteinorviralvectorparticlesbeingpurified.Theuseofdetergentsforcelllysiscreatesaseparatechallengeinthegenerationoffoamwhileprocessing,whichcanleatoproduclossandmanufacturingflooradverseevents.Amongchemicalmethods,TritonX-100hasbeenthepreferreddetergentforviralvectorpurifcationprocessesduetoitssuperorperformance2.However,researchhasshownthatTritonX-100caussacueoraltoxicity,eyedamage,skinirritation,andchronicaquatctoxicity3.Aaresult,thedetergenthasbeendesignateda“substanceofveryhighconcern”bytheEuropeanChemicalsAgency’sRegistraton,Evalun,AuthorizationandRestrictionofChemicals(REACH)regulations,inDecember20124.REACHisaEuropeanUnionregulationenactedinDecember2006toaddresschemicalsafetyonbothhumanhealthandtheenvironment.ThedetergenthasbeenbannedforuseinEuropesinceJanuary2021andotherregionsoftheglobemayfollow5.Inthisstudy,thefoamheightgenerationoftheJ.T.Baker®CellLysisSolutionwascomparedtoTritonX-100todetermnewhetherJ.T.Baker®CellLysisSolutionmaypotentiallycreateadversefoamingconditionsduringviralvectorbioprocessing.MATERIALSANDMETHODSInordertoassessthefoamingcharacteristicsoftheJ.T.Baker®CellLysisSolutioncomparedtoTritonX-100,foamheightdeterminationswerecarriedouaccordingtoASTMD1173,StandardTestMethodforFoamingPropertiesofSurface-ActiveAgents6.Allfoamheightmeasurementswerecarriedoutat25°C(ambienttemperature)usingaRoss-MilesFoamApparatus(VWRCat#14007-876)byWilmad-Labglass.ThefoamheightofJ.T.Baker®CellLysisSolutionandTritonX-100wasmeasuredat0.1%detergentconcentrationattimezeroandafter5minutesofhold.J.T.BAKER®CELLLYSISSOLUTIONFOAMHEIGHTGENERATIONThefoamheightresultsattimezeroandafter5minutesofholdtimeareshowninFigure1.ThefoamheightgeneratedbyJ.T.Baker®CellLysisSolutionwasabout28%and33%lowrattimezeroandafter5minutesofholdcomparedtoTritonX-100,respectivelyThefoamdsspatonratewaslsoquickerfornovelcelllysissolution(2.9%perminute)thanTritonX-100(1.6%perminute).Thefoamdissipationratewascalculatedas:Figure1:FoamdevelopmentassessedbyRossMilesfoamheightanalysisattwotimepoints.020406080100120140TritonX-100FoamHeight(mm)T=0(baseline)CellLysisSolutionT=5minCONCLUSIONSFoamingofdetergent-basedcellysissolutionsisachallengethatmustbemanagedcarefully.Excessivefoamformationotonlycreatesamessonthemanufacturingfloor,butitisalsodifficulttoclean.Generationoffoamcanalsoresultinlossofyieldoftheproteinorviralvectorthatisbeingisolated.Ideally,solutionsusedforcelllyssshouldbeabletolysecellswithoutcreatingtoomuchfoam.J.T.Baker®CellLysisSolutionfoamsabout30%lessanddissipatequickerthanTritonX-100.ThislowfoamingmakesJ.T.Baker®CellLysisSolutioneasytouse.J.T.Baker®CellLysisSolutionisalsoreadytouseandmeetstheOECDguidelineforreadilybiodegradablematerialaccordingtoOECD301.REFERENCES01.Islam,M.S.,Aryasomayajula,A.&Selvaganapathy,P.R.Areviewonmacroscaleandmicroscalecelllysisms.Micromachines8,(2017).02DiasFlorencio,etSimpledownstreamprocessbasedondetergenttreatmentimprovesyieldandinvivotransductionefficacyofadeno-associatedvirusvectors.Mol.Ther.-MethodsClin.Dev.2,1–7(2015).03Moleirinho,M.G.etal.Clinical-gradeoncolyticadenoviruspurificationusingpolysorbate20asanalternativeforcelllysis.Curr.GeneTher.18,366–374(2018).04.“Candidatelistofsubstancesofveryhighconcernforauthorisation”.EuropeanChemicalsAgency.RetrivedMarch22,2022.05Farcet,J.,Kindermann,J.,Karbiener,M.&Kreil,T.R.DevelopmentofaTritonX‐100replacementforeffectivevirusinactivationinbiotechnologyprocesses.Eng.Reports1,1–10(2019).06ASTMInternationaStandardTestMethodforFoamingPropertiesofSurface-ActiveAgents.(2007)07.structureandcellinteractions.GeneTherapyvol.807(2011).08.Rayaprolu,V.etal.Comparativeanalysisofadeno-associatedviruscapsidstabilityanddynamics.J.Virol.87,13150–13160(2013).Foamdissipationrate=Foamheightatt=0-Foamheightatt=5mintime(5min.)細胞溶解にはいくつかの機械的および化学的方法があります。（⁰¹）遊離させるための初歩的な機械技術細胞からの組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは凍結/解凍サイクルを経た後、低速遠心分離で清澄化されます。ただし、この技術はスケールアップが難しいため、AAVの大規模な精製には適していません。機械的均質化を使用すると、高いせん断力によって膜を破壊できます。この方法は拡張可能ですが、せん断応力によるウイルスベクターの凝集と沈殿による生成物の損失という欠点があります。オクトキシノール9（Triton™X-100としても販売）やデオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの化学的手法は、精製されるタンパク質またはウイルスベクター粒子に対する細胞破壊が機械的方法よりも過酷ではないため、細胞溶解の主要な界面活性剤として使用されています。（⁰²）細胞溶解に界面活性剤を使用すると、加工中の泡の生成に別の課題が生じ、製品の損失や製造現場での有害事象につながる可能性があります。科学的方法の中でも、TritonX-100はその優れた性能により、ウイルスベクター精製プロセスに好まれる界面活性剤です。（⁰²）しかし、研究により、TritonX-100は急性経口毒性、目の損傷、皮膚刺激を引き起こすことが示されており、慢性水性毒性をもった界面活性剤として、欧州化学庁の登録、評価、認可および制限（REACH規制）により「非常に懸念される物質」に指定されています。（2012年12月）（⁰³-⁰⁴）REACH規制は、人間の健康と環境の両方に対する化学物質の安全性に対処するために、欧州連合で2006年12月に制定された規制です。この界面活性剤は、2021年1月からヨーロッパでの使用が禁止されており、世界の他の地域でも同様の措置が取られる可能性があります。（⁰⁵）この研究では、ウイルスベクターのバイオプロセス中にTritonX-100と比較してJTBaker®CellLysisSolutionの生成した泡の高さが優位に低く抑えられている可能性があります。界面活性剤ベースの細胞溶解液の泡立ちは、慎重に管理する必要がある製造上の課題です。泡の発生により、単離されるタンパク質またはウイルスベクターの収量が低下する可能性があるため、細胞溶解に使用される溶液は、泡をあまり生成せずに細胞を溶解できる必要があります。JTBaker®CeLysisSolutionは、TritonX-100よりも泡立ちが約30％少なく、消散が速くなり、使いやすくなっています。また、OECD301に基づく易生分解性材料に関するOECD301ガイドラインを満たしており、問題なく使用できます。結論時間ゼロおよび5分間の保持後の泡の高さを測った結果を図１に示します。JTBaker®CelllysisSolutionによる濃度は、TritonX-100と比較して、時間ゼロおよび5分間の保持後にそれぞれ約28％および33％低いです。泡の消失速度もTritonX-100（1.6％/分）よりも新しい細胞溶解液（2.9％/分）のほうが速いです。なお、泡消散速度は次のように計算されました。JTBaker®細胞溶解ソリューションの泡の高さJTBaker®CelllysisSolutionの発泡特性を評価するには、細胞溶解液とTritonX-100を比較し、泡の高さの測定をASTMD1173（界面活性剤の泡立ち特性の標準試験法を用いました。（⁰⁶）すべての泡の高さの測定は、Wilmad-Labglass製のRoss-Miles発泡装置（VWRカタログ番号14007-876）を使用して25℃（周囲温度）で実施されました。材料および方法図1：2つの時点でロスマイルズ泡高さ分析によって評価された泡の発生泡消散率＝t=0での泡の高さ−t=5分での泡の高さ時間（5分）